一、实验内容
（1）准备阶段
通过文字、动画等介绍实验目的，多肽的概念、作用及固相肽合成原理、以及实验设备与仪器，同时熟悉课程思政内容。
（2）虚拟仿真操作
版块一 固相多肽合成
1. 将试剂瓶装满所需试剂
2. 氨基酸的计算与称量
Tribute peptide synthesiser每次合成的多肽量为0.3 mmol，每个氨基酸应至少是所需量4倍。此外，活化剂催化偶联的比例为1:1，因此，活化剂（HBTU）也需称4倍于多肽的量。
具体操作如下：
①清水清洗合成管三次，甲醇润洗一遍后烘干。
②称取1.2 mmol HBTU装入洗净干燥的合成管中。
③每种氨基酸称取1.2 mmol后装入含HBTU的合成管中并封管。
3. 根据肽链C端，挑选合适的 Wang Resin或Rink Amide Resin，称取0.3 mmol树脂装入30 mL的反应容器中并将反应容器装上固相合成仪。
4. 检查固相合成仪溶剂过滤器和氮气源；排出气泡并准备足够合成用试剂；加压并灌注试剂瓶；在转盘上插入合成管；选择每个氨基酸的偶联程序（如下表，第2-8步循环）；按RUN开始合成。
裂解反应:
①将干燥的树脂从反应容器中取出称重，然后将其转移到带有搅拌器的100 mL圆底烧瓶中。
②根据树脂的重量，以25 mL/g计算所需裂解液总体积。按照比例配置裂解液：94% 三氟乙酸 (TFA) + 2% 乙二硫醇 (EDT) + 2% 三异丙基硅烷 (Tips) + 2 % H2O。
③将裂解液与树脂混合，室温下磁力搅拌反应6-8小时。
④完成裂解反应后，使用布氏漏斗过滤裂解混合物，然后通过旋转蒸发将滤液浓缩至接近干燥（水浴锅温度不超过40℃）。
多肽洗涤
①将浓缩液转移至于50 mL离心管中并加入45 mL冰乙醚（Et2O），震荡后置于-20℃冰箱静置过夜完成肽的析出沉淀。
②第二天取出离心管5000 g 离心5分钟，弃去上清液，然后再次向管中加入45 mL Et2O。
③整个过程重复3次，最后一次上清应尽可能弃干净。
使用10 - 20 mL ddH2O溶解肽沉淀后将离心管在液氮中速冻15分钟。
然后将离心管（去盖换有孔锡纸）放于冷冻干燥机中冻干约60小时后即可得到多肽粉末。此时可用质谱测定合成产物的分子量以判断固相合成是否成功。若需提纯多肽可进一步结合液相。
版块二 抑菌活性测定
1.待测菌活化
将待测细菌在灭菌MH肉汤琼脂平板上过夜培养,挑取菌落接种于灭菌试管中的MH肉汤，37℃250 r/min过夜培养。将培养后的菌液取30 μL转接至3 mL新鲜MH肉汤液体培养基中，37℃250 r/min恒温震荡培养2～5 h至对数生长期。将上述2次活化的菌液稀释至2105～7105CFU/mL。
2.最小抑菌浓度（MIC）实验
采用Hancock实验室改良的微量肉汤稀释法测定。
分别精密称取1号抗菌肽2.0 mg、2号抗菌肽2.0 mg及1号抗菌肽和1号抗菌肽各2.0 mg于3个4mL离心管，用无菌水溶解，分别制备成1.0 mg/mL的供试品溶液，并稀释为50、25、0.125、0.1、0.05和0.025 μg/mL系列浓度。
将稀释好的1号抗菌肽各取10 μL依次加入到96孔板B-D行的各个孔内(重复的两行作为副孔)，2号抗菌肽各取10 μL依次加入到96孔板E-G行的各个孔内，1号抗菌肽和2号抗菌肽混合各取10 μL依次加入到96孔板B-D行的各个孔内。无菌水代替供试品溶液作为阴性对照加入到96孔板A行。
将增菌后的菌液稀释成浓度为5105CFU/mL，依次取90 μL加入到有抗菌肽的所有孔内。
96孔板盖盖后，用医用胶带封口，37℃振荡培养24 h。
3.抑菌圈实验
①倒平板：在超净台里将培养基倒入平板，每板约15 mL左右，水平放置，凝固后倒置放入30℃恒温培养箱中，2 d后观察是否有菌落生长，若没有则可供下一步实验使用，否则需重新倒平板。
②涂布：用微量移液器分别取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌发酵液200 μL加到（1）检测过的平板培养基上，用涂布器在平板上涂抹均匀直至干燥。
③取无菌并干燥的滤纸片(Φ=5mm)，每片精密滴加1 mg/mL样品20 μL(每个样品做3个重复），置清洁无菌平皿内，无菌操作台干燥后备用。取无菌干燥滤纸片，每片滴加无菌蒸馏水20μL，制备成阴性对照样片。
④将（3）中做好的3样品和1个对照放于同一个平板的四个角，于37℃恒温恒湿培养箱培养24～48h。
⑤用游标卡尺测量出抑菌圈直径大小。
板块三
通过在线测试检测学生的学习情况，并提交实验报告
二、实验步骤，共 15 步
步骤序号 | 步骤目标要求 | 步骤合理用时 | 目标达成度赋分模型 | 步骤满分 | 成绩类型 |
1 | 使学生预习实验的研究背景 | 20 | 持续点击完成整个背景介绍学习 | 5 | £操作成绩 R实验报告 £预习成绩 R教师评价报告 |
2 | 使学生了解课程思政内容 | 5 | 学习完课程思政内容 | 5 |
3 | 使学生初步熟悉本实验的研究目的 | 5 | 持续点击完成整个研究目的介绍学习。 | 5 |
4 | 使学生初步掌握本实验的实验原理 | 5 | 持续点击完成整个研究实验原理。 | 5 |
5 | 使学生初步了解本实验研究设备与试剂 | 5 | 持续点击完成整个研究设备与试剂知识的学习。 | 5 |
6 | 使学生初步掌握本实验试剂准备的步骤 | 5 | 持续点击完成试剂准备步骤的学习。 | 5 |
7 | 使学生初步掌握本实验氨基酸的计算与称量的步骤 | 5 | 持续点击完成氨基酸的计算与称量步骤的学习。 | 5 |
8 | 使学生初步掌握固相多肽合成仪运行前的检查、预备和程序设置步骤 | 10 | 持续点击完成固相多肽合成仪运行前的检查、预备和程序设置步骤的学习。 | 5 |
9 | 使学生初步掌握合成多肽裂解反应的步骤 | 5 | 持续点击完成多肽裂解反应步骤的学习。 | 5 |
10 | 使学生初步掌握多肽洗涤的步骤 | 5 | 持续点击完成多肽洗涤步骤的学习。 | 5 |
11 | 使学生初步掌握多肽粉末获取的步骤 | 5 | 持续点击完成多肽粉末获取步骤的学习。 | 5 |
12 | 使学生初步掌握菌种活化步骤 | 5 | 持续点击完成菌种活化步骤的学习。 | 5 |
13 | 使学生初步掌握多肽最小抑菌浓度测定实验 | 5 | 持续点击完成多肽最小抑菌浓度测定实验的学习。 | 5 |
14 | 使学生初步掌握多肽抑菌圈实验 | 5 | 持续点击完成多肽抑菌圈实验的学习。 | 5 |
15 | 使学生完成实验的思考题、提交实验报告 | 30 | 持续点击完成整个实验的思考题及提交实验报告 | 30 |