步骤1 安全准入选择题考核
操作目的：掌握实验室安全相关知识。
操作过程：完成选择题
操作结果：对选择题进行判定，并给出分数。
步骤2 细胞复苏
操作目的: 此实验是采用快速融化的方式，将冷冻的细胞进行复苏，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
操作过程：
1）培养基水浴预热，冻存细胞水浴解冻；
2）解冻后的细胞液加入培养基，振荡培养；
3）三维动画展示细胞在解冻中发生的变化；
水浴锅中加热
细胞复苏存原理动画
操作结果：细胞外结晶在很短的时间内即融化，细胞被复苏了。
步骤3 细胞传代
操作目的：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代培养。
操作过程：
1）对复苏后的CHO细胞液进行计数，确定细胞生理状态；
2）培养细胞换液，离心后弃除培养液，更换新鲜培养基；
3）再对细胞液进行振荡培养。
传代细胞计数
细胞培养
操作结果：传代后，细胞的密度需要达到 3105个/mL。
步骤4 细胞转染
操作目的：将目的基因通过脂质体法转染进入细胞中。
操作过程：
1）传代后的细胞进行震荡培养；
2）培养液和质粒混合，培养液和转染试剂混合，需要输入转染试剂的量；
3）上述溶液混合，转染试剂与质粒的比例不同，会导致不同的实验结果；
4）三维动画展示造成不同实验结果的原因。
输入转染试剂的量
系统判定实验成功与否
三维动画揭示实验成功与失败的原因
实验结果：当脂质体和质粒的比例合适，转染成功且效率很高，如果比例不对则会造成转染失败。通过多条不同路径，推演产生不同的结果，系统会根据结果给出不同的得分。
步骤5 细胞株筛选-G418筛选
操作目的：G418 是一种氨基糖类抗生素，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性。neo抗性基因带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式，当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长，因此，就可利用G418来对转染后的细胞进行筛选，被转染成功的细胞可以存活。
操作过程：
1）转染后的细胞，离心后弃掉原培养液，加入G418筛选培养基后，进行传代培养；
2）三维动画展示G418阻断蛋白质合成，对细胞有毒性，被转染的细胞生成抗性产物，抵抗G418毒性。
G418试剂筛选
G418筛选原理
操作结果：获得更换为G418筛选培养基的细胞液。
步骤6 细胞株筛选-台盼蓝染色计数
操作目的：利用台盼蓝染色经过筛选的细胞是否存活，并进行计数。
操作过程：培养中进行台盼蓝染色计数，筛选出活率较高的细胞；
台盼蓝染色后计数
操作结果：筛选后经台盼蓝染色观察，活率大85%的细胞可用于后续实验。
步骤7 细胞株筛选-基因组DNA提取
操作目的：将细胞裂解，提取其中的基因组DNA并测定DNA浓度；
操作过程：制备细胞悬液，并将细胞进行裂解，再提取基因组DNA，对DNA样品稀释，并测定吸光度；
基因组DNA提取
DNA浓度测定
操作结果：提取的DNA妥善保存，用于后续检测；
步骤8 G418加压筛选-第一轮筛选
操作目的：对经过初步筛选的细胞，利用不同浓度的G418试剂再次进行筛选。
操作过程：利用不同浓度梯度的G418对初步筛选的细胞液再次进行筛选；
第一轮筛选梯度浓度设定
操作结果：部分细胞会再被杀死，符合要求的细胞会被筛选出来。
步骤 9 G418加压筛选-台盼蓝染色计数
操作目的：利用台盼蓝染色，检测并对活细胞数进行计算；
操作过程：不同G418浓度的细胞进行染色观察；
台盼蓝染色计数
操作结果：得到筛选后活细胞的数量，根据数量决定后续操作步骤；
步骤10 G418加压筛选-换液培养
操作目的：调整G418浓度再次对剩下的活细胞进行多轮筛选；
操作过程：1）第一轮筛选后当活细胞下降到1105个/mL时，离心收集细胞，更换G418终浓度为50 ng/mL的新鲜完全培养基；
2）如果3天内活细胞没有下降至1105个/mL时，同样要进行离心换液，但G418的浓度不变，直到活细胞的浓度1105个/mL时；
3）进行多轮筛选，每轮需要冻存种子细胞。
设定第二轮G418的终浓度
更换G418培养基
操作结果：筛选后可获得稳定的细胞株。
步骤11 单克隆细胞株的筛选-检测TGF-β活性
操作目的：检测细胞表达分泌的TGF-β是否具有活性；
操作过程：制备细胞悬液，并对tgf-β进行倍数稀释，再利用成纤维细胞的增殖实验检测tgf-β活性，会有三维动画解释tgf-β检测原理。
利用酶标仪测定
TGF β活性检测原理展示
操作结果：获得TGFβ作用成纤维细胞的增值结果，可判断重组蛋白的活性。
步骤12 单克隆细胞株的筛选-单克隆筛选
操作目的：对TGF-β分泌量最高的种子细胞，进行倍比稀释筛选出单克隆细胞株。
操作过程：
1）将种子细胞进行倍比稀释，确保最末稀释的培养液中细胞为1个/孔；
2）然后进行静置培养，对培养后的细胞进行ELISA鉴定选出优势单克隆，再扩大培养；
倍比稀释
操作结果：筛选出优势单克隆细胞。
步骤13 种子细胞保存
操作目的：在G418多轮筛选以及单克隆筛选过程中，需要进行种子细胞的冻存，避免实验失败后需要重头开始。
操作过程：
1）在种子细胞中加入DMS冻存保护液；
2）再先经过冰箱缓慢冻存后；
3）放到液氮罐中进行保存；
4）三维动画展示细胞冻存过程中微观变化。
放入液氮罐中
冻存原理
操作结果：获得冻存细胞。
步骤14 插入基因检测-引物设计
操作目的：针对目的基因设计引物，作为后续PCR扩增的引物。
操作过程：在引物设计网站中输入基因名称和种属，并设定PCR反应条件，即可获得所需要的引物。
获得所需引物
操作结果：获得所需引物。
步骤15 插入基因检测-PCR扩增
操作目的：利用引物，以细胞基因组DNA为模板进行扩增，
操作过程：先制备扩增反应体系，再将基因组DNA与扩增反应体系混合，再制备完成的PCR扩增体系在PCR仪中扩增。
PCR扩增
操作结果：获得以细胞基因组DNA为模板的DNA片段。
步骤16 插入基因检测-测序比对
操作目的：对扩增产物测序，与目的基因进行序列比对。
操作过程：将测序结果与网站中目的基因的信息进行比对。
与目的基因进行测序比对
操作结果：获得测序比对报告，细胞基因组DNA含有目的基因。
步骤17 插入基因检测-标准品的制备
操作目的：对荧光定量PCR所需要的样品进行制备。
操作过程：计算线性质粒和细胞基因组的标准品的初始拷贝数，按照要求的终浓度梯度稀释线性质粒和细胞基因组，将不同浓度的线性质粒与细胞基因组等体积混合，构建以拷贝数为梯度的标准样品；
标准样品制备
操作结果：制备好荧光定量PCR检测所需要的标准样品。
步骤18 插入基因检测-荧光定量PCR检测插入基因拷贝数
操作目的：荧光定量PCR检测细胞基因组中插入基因的拷贝数。
操作过程：
1）制备TGF-β基因反应体系；
2）制备β-Actin基因反应体系，
3）制备荧光定量PCR反应体系，并对标准样品进行荧光定量PCR测定，得出标准曲线，并检测样品；
4）将样品的Ct值代入标准曲线计算出插入基因拷贝数。三维动画展示荧光定量PCR检测原理。
荧光染料掺入法定量PCR检测DNA原理
荧光定量PCR测定
操作结果：可计算得到外源插入基因的拷贝数。
步骤19 ELISA检测法-样品和试剂准备
操作目的：制备用于ELISA检测的样品和试剂；
操作过程：先进行缓冲液稀释，样本酸化及终止，标准品溶解和稀释，检测抗体稀释，以及HPR酶溶液稀释；
样品以及试剂的制备
操作结果：获得用于ELISA检测的样品和试剂。
步骤20 ELISA检测法-加样和检测
操作目的：ELISA法检测出表达产物的量
操作过程：
1）洗去酶标板中的抗体保护剂，加入检测缓冲液，酶标板中的A1-3至G1-3加入不同浓度的标准溶液(n=3)，H1-3加入检测样品(n=3)，再加酶标抗体，封闭酶标板孵育；
2）孵育结束后，撕除封膜，轻轻甩去液体并排干，反复进行洗板，加入TMB后孵育，加入终止液，测定吸光度，计算获得浓度；三维动画展示检测原理。
ELISA法检测表达产物洗板
酶标仪检测
检测原理展示
操作结果：通过酶标仪检测出吸光值换算成表达产物的量。
步骤21 Western Blot检测法-蛋白质样品准备
操作目的：制备可用于BSA法的蛋白质样品
操作过程：将细胞裂解，并离心再用注射器进行反复吹打混匀，再离心，并在冰箱中进行保存。
裂解细胞
操作结果：获得表达产物粗品。
步骤22 Western Blot检测法-蛋白质含量测定
操作目的：测定蛋白质含量
操作过程：利用BSA法通过酶标仪测定蛋白质浓度，需要先制备标准曲线，再检测样品。
BSA法检测蛋白质含量
操作结果：得到样品的蛋白质含量，作为后序稀释样品的数据参考
步骤23 Western Blot检测法-SDS-PAGE电泳
操作目的：将样品中的蛋白质按照分子量的大小进行分离；
操作过程：制备电泳胶，加入样品和marker，再进行电泳分离，三维动画展示电泳原理。
对样品进行电泳分离
电泳原理
操作结果：得到了样品蛋白质在凝胶中的分离电泳图
步骤24 Western Blot检测法-转膜
操作目的：将电泳图从凝胶中转移到PVDF膜上
操作过程：将凝胶盖在PVDF膜上，垫上滤纸和海绵垫，放在转印夹上，开始转膜；
电泳图转移到PVDF膜上
操作结果：在PVDF膜上面得到分离电泳图；
步骤25 Western Blot检测法-显影
操作目的：通过显影的X-光片上的条带来分析表达产物的量。
操作过程：用脱脂奶粉浸泡PVDF膜，加入一抗，进行振荡孵育，再加入酶标二抗，TBST溶液洗涤，处理后进行显影。三维动画展示实验原理。
Western blot法检测表达产物-在显影仪中进行显影
Western blot法检测原理展示
操作结果：利用Western blot法检测得到表达产物的量。
步骤26 产物小试发酵工艺优化
操作目的：探究产物小试发酵工艺的最优条件。
操作过程：
1）先设定各影响因素的水平值
2）系统模拟出实验结果
3）根据实验结果分析出最优工艺条件
4） 对最优工艺条件进行验证
5） 系统判定整个工艺优化过程
操作结果：得到产物小试发酵工艺各因素的最优水平。
实验步骤27 产物规模化发酵与纯化工艺设计
操作目的：设计产物规模化发酵与纯化工艺流程和各岗位参数。
操作过程：
1）先对工艺流程进行设计
2）每个工艺单位需进行工艺参数设定
3）系统判定工艺设计过程
操作结果：设计出产物规模化发酵与纯化工艺流程和各岗位参数。
实验步骤28 完成并上传实验报告
完成上述步骤以后，需要点击报告模板下载实验报告，填写完成后，再点击上传报告按键进行上传。
